尊龙凯时人生就是搏官网基因編輯平台初建於2009年公司成立之初，主要負責研發動物、細胞模型。基因編輯模型不僅在基礎科學研究中發揮了極大地作用，也可以解決抗體藥物研發過程中的諸多關鍵問題。使用全人抗體RenMab小鼠，可以直接獲得全人序列且經過免疫係統篩選的抗體分子。全人共同輕鏈抗體RenLite小鼠中獲得的全人序列抗體分子，具有重排後的相同輕鏈序列，這解決了雙特異抗體在蛋白表達過程中的錯配問題。而僅重鏈抗體RenNano小鼠可以用於開發全人序列的納米抗體。

此外，當篩選的抗體分子隻能夠識別人靶點，而不識別小鼠同源靶點時，靶點人源化小鼠/細胞模型則可以解決其在藥物安全性評價、藥效評價、機製研究等方麵所麵臨的問題。除了以上應用，基因編輯模型的作用實際上非常廣泛，比如：通過修飾某些基因而提高抗原的免疫反應，通過遺傳改造誘導製備疾病模型，等。

經過多年的自主技術研發，尊龙凯时人生就是搏官网建立了三個主要的基因編輯技術體係：（1）基於小鼠胚胎幹細胞的ESC/HR技術，我們自主建立的小鼠胚胎幹細胞係可以經過近70次的傳代仍然具有發育全能性，允許在同一染色體進行多輪的基因改造；（2）EGE技術，將CRISPR/Cas9介導的基因敲進效率提高近20倍。（3）SUPCE技術，不受DNA片段長度限製，最多通過3次的小鼠胚胎幹細胞操作，即可一次性人源化超大基因片段。綜合三種技術體係，我們克服了基因編輯技術中普遍存在的問題，實現了高效率、大規模、多重改造、超大基因人源化，幾乎可以實現任意長度、任意位點的精確基因組編輯。

除了自主研發的基因編輯技術，建立自動化、高通量的技術流程才能夠保證快速穩定的大規模模型製備。平台配備了多台96通道核酸提取儀用於小鼠/細胞基因組DNA和質粒DNA的提取。使用自動化移液工作站實現了基因型檢測的全自動化操作。基因編輯平台現每年可以實現1500個以上的模型開發工作。

ESC/HR

ESC/HR (ESC, Embryonic Stem Cell; HR, Homologous Recombination) 是在小鼠胚胎幹細胞中，利用供體DNA與基因組之間的同源重組進行基因編輯的一種技術。基因改造的陽性克隆可以通過注射到小鼠囊胚和後續的繁育最終獲得成體小鼠。尊龙凯时人生就是搏官网自主建立的C57BL/6背景的幹細胞係以及培養體係，可以保證經過近100次的傳代後仍可以具有全能性，獲得成體小鼠。

EGE

EGE (Extreme Genome Editing system) 是一種以CRISPR/Cas9為基礎，經過自主研發優化後，將基因敲進效率提高近20倍的基因編輯技術。雖然CRISPR/Cas9極大提高了同源重組的發生概率，簡化了基因編輯操作，但在大規模的模型製備中仍然存在效率低、成本高的問題。EGE係統使得基因編輯更加快速、便捷，可以精確編輯幾乎任何基因組位點的DNA序列。基因編輯效率的提高帶來了多方麵的好處。首先，對於模式動物製備，提高了成功率，節約了成本，縮短了周期，更有利於工業化及大規模的商業應用；其次，鑒於不同基因的改造難度不同，對於部分非常難以改造的基因組位點，EGE技術對效率的提高則有望將不可能變為可能。

圖1. EGE係統大幅提高基於CRISPR/Cas9的基因敲進效率

在第一個模型中（圖左），使用人骨肉瘤細胞，設計方案為在人細胞骨架蛋白β-Actin基因ACTB的起始密碼子ATG後敲進綠色熒光蛋白EGFP，成功敲進的細胞會表達EGFP融合的β-Actin蛋白。U2OS細胞轉染表達Cas9核酸酶與靶向ACTB的sgRNA質粒，以及兩側含有約1kb長度同源臂的EGFP供體質粒。轉染後通過流式細胞術分析，基本的Cas9/sgRNA介導的敲進效率為1.91%，而EGE係統可以將敲進效率提高至15.02%。在第二個模型中（圖右），選擇大鼠膠質瘤C6細胞，以及編碼核膜蛋白的大鼠Lmnb1基因作為靶點。在這個模型中EGE係統將敲進效率從0.19%提高至3.6%。

圖2. EGE技術實現在細胞中同時標記兩個基因

在U2OS細胞中共轉染分別靶向ACTB，LMNB1基因的Cas9/sgRNA質粒，以及標記ACTB的綠色熒光蛋白GFP供體質粒，標記LMNB1基因的紅色熒光蛋白mCherry供體質粒。轉染後熒光顯微鏡觀察，可以發現紅色的核膜蛋白與綠色的細胞骨架蛋白。

SUPCE

SUPCE (Size-Unlimited and Precise Chromosome Engineering system) 是一種不受DNA片段長度限製的基因組編輯技術。以往使用質粒或細菌人工染色體(BAC, Bacterial Artificial Chromosome) 進行大片段的替換需要在小鼠胚胎幹細胞中進行多輪的改造。由於供體容量的限製，改造的次數與替換片段的長度成正比。小鼠ES細胞在體外長期操作很容易失去其全能性，從而造成無法獲得成體小鼠。SUPCE在本質上解決了這個問題。在理論上，無論需要替換的片段是多大，就隻需要三輪的小鼠ES細胞改造，即可成功實現目的片段的替換。

利用SUPCE技術，尊龙凯时人生就是搏官网成功開發了全人抗體RenMab小鼠 （圖1），圖2的FISH檢測結果驗證了人重鏈、κ輕鏈序列成功替換至小鼠基因組的對應位置。除了抗體基因，SUPCE技術也可應用於其它超大基因簇的人源化，如：T細胞受體 (TCR, T-Cell Receptor)，主要組織相容性複合體 (MHC, Major Histocompatibility Complex)，NK細胞基因簇(NKC, NK Cluster) 等。

圖1. RenMab小鼠中抗體基因人源化設計示意圖

在RenMab小鼠中，一次性將2.6 Mb的小鼠重鏈可變區替換為1.0 Mb的人重鏈可變區序列，將3.2 Mb的小鼠κ輕鏈可變區替換為1.6 Mb的人輕鏈可變區序列。

圖2. 抗體基因可變區人源化替換的FISH檢測結果

利用SUPCE技術在小鼠胚胎幹細胞中分別將小鼠重鏈、κ輕鏈的可變區替換為完整的人源序列。a. 使用人重鏈可變區序列探針（綠色），小鼠Igh所在的#12號染色體全塗染探針（紅色），對重鏈人源化細胞克隆進行檢測。b. 使用人κ輕鏈可變區序列探針（紅色），小鼠Igk所在的#6號染色體全塗染探針（綠色），對κ輕鏈人源化細胞克隆進行檢測。